•  Выделение изолированных кардиомиоцитов у мелких лабораторных животных.
  Для получения изолированных кардиомиоцитов применяется процедура перфузии изолированного сердца по Лангендорфу [например, Kamkin et al., 2023; Kamkin at al., 2022]. У изолированного сердца на канюле сначала промываются коронарные сосуды раствором PSS без Ca2+ с подачей карбогена в течение 5 мин при потоке 1 мл/мин и 37°C. Затем сердце ретроградно перфузируется PSS, дополненным коллагеназой Worthington type II (0,5 мг/мл), 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (Sigma) и 10 мкмоль/л CaCl2 в течение 18-20 мин. После этого ферменты вымываются модифицированной средой KB и сердце отсоединяем от перфузионной системы. Желудочки вырезают, разрезают на полосы размером 3 мм, которые держат пинцетом за кончик и интенсивно встряхивают в растворе KB, чтобы высвободить клетки в среду KB. Полученную клеточную суспензию фильтруют и перед использованием хранят в среде KB при 22°C.
• Световая микроскопия.
• Флуоресцентный имидждинг.
  Например, изучение изменения длины саркомеров, которые являются основными сократительными элементами, в изолированных кардиомиоцитах в экспериментах на контрольных крысах и крысах, подвергнутых моделируемой микрогравитации. Фактическая длина саркомера (SL) важна для сократительного ответа всей клетки в кардиомиоцитах. SL изолированного кардиомиоцита без S и P рассчитываеться по расстоянию между саркомерами, лежащими на линии в центре клетки. До и во время растяжения клетки до фиксированных длин в изолированных кардиомиоцитах SL оцениваются по расстоянию между десятью саркомерами, лежащими на линии, соединяющей S и P. Анализ изменчивости в отдельных SL реализован с помощью стандартных оптических изображений в стандартной световой микроскопии. В части случаев приминяется ANEPPS чтобы выявить регулярность инвагинаций t-трубочек клеточной мембраны [Lookin et al., 2023]. Непосредственно перед началом измерений с ANEPPS кардиомиоциты помечаются флуоресцентным di-4-ANEPPS следующим образом: 0,2 мкл ANEPPS (1 мМ исходный раствор DMSO) будут добавлены к 1 мл клеточной суспензии в растворе Тироде при комнатной температуре. После 10-минутной обработки красителем супернатант удаляется и меняется на 3 мл свежего Тироде без красителя. Клетки помещаются в перфузионную камеру. Во всех измерениях исследуемые области клетки размещаются так, чтобы покрывать как можно большую площадь клетки, но их длины и углы устанавливаются так, чтобы они соответствовали прямой части миофибрилл. Изогнутые миофибриллы, пересекающиеся миофибриллы или миофибриллы с нерегулярным окрашиванием по длине исключаются из выборки [Lookin et al., 2023]. Анализ внутриклеточной изменчивости в SL проводится с использованием стандарта для полностью расслабленных и нерастянутых кардиомиоцитов и растянутых кардиомиоцитов.
• Микроэлектродная регистрации биоэлектрической активности клеток.
  Используется экспериментальная установка, обеспечивающую регистрацию потенциалов клеток и искусственную внутриклеточную поляризацию их мембран с применением одного или двух плавающих микроэлектродов.
• Регистрация ионных токов методом локальной фиксации потенциала (patch clamp) у кардиомиоцитов.
• Конфокальная микроскопия.
  При помощи конфокальной микроскопии исследуются изменения цитоскелета у кардиомиоцитов крыс, подвергнутых различным внешним воздействиям, по сравнению с контрольными животными.
• Растяжение кардиомиоцитов.
  Метод механической стимуляции, совмещаемый с методом patch-clamp, подробно описан [Kamkin at al., 2023; 2022]. После доступа к целой клетке с помощью пипетки-патча (P), полированный стеклянный стилус (S, диаметр 14±0,8 мкм), имеющий форму полусферы, прикрепляется к мембране. Площадь контакта между стеклянным стилусом и поверхностью клетки составляем менее 200 мкм2. Кончики S и патч-пипетки направлены друг к другу и имеют угол 45° по отношению к стеклянному дну. S и P располагаются на расстоянии 40 мкм друг от друга перед прикреплением их к клетке. Моторизованный микроманипулятор увеличивает расстояние S-P поэтапно до 12 мкм, при этом P является фиксированной точкой.
• Изучение уровня транскрипции генов ионных каналов в изолированных кардиомиоцитах.
  Изучения изменений в профиле РНК-транскриптома как полного генома, так и генов механоуправляемых каналов в изолированных кардиомиоцитах изучают применяя метод секвенирования РНК-транскриптома (RNA-seq technique) (например, Kamkin et al., 2023). Из изолированных кардиомиоцитов РНК с применением TRIzol, хлороформа и набора RNeasy mini kit согласно протоколам производителей. Концентрация, чистота, количество и качество РНК определяем с использованием Nanodrop, Qi RNA kit, флуориметра Qubit 4, dsDNA high sensitivity kit и High Sensitivity D5000 kit. Образцы готовим с NEB Ultra II RNA kit и NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation. Полученные библиотеки нормализуем, количественно оцениваем и наносим на S2 FlowCell с последующей загрузкой в NovaSeq 6000. Проведение RNA-seq делаем, как это принято, в трех повторах. Сырые данные FASTQ оцениваем качественно, обрезаем адаптеры и выравниваем на референсный геном mRatBN7.2.108 с помощью FastQC, Trimmomatic, HISAT2 и SAMtools. Выравнивания передаются в HTSeq-count для подсчета ридов подсчета транскриптов гена каналов. Дифференциальную экспрессию анализируем с помощью DESeq2, где гены с вероятностью различия P<0.05 признаются дифференциально экспрессированными.
• Изучение уровня синтеза белков ионных каналов.
  • Western Blot
    Клетки лизируем в буфере, содержащем 10 мМ Трис (pH 8), 140 мМ NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5 мМ EGTA, 1 мМ EDTA и смесь ингибиторов протеазы (Roche). Образцы кипятим в буфере для образцов Лэммли при 95°С в течение 5 мин. Белки разделяем в SDS-PAGE и переносим на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокироуем 5% обезжиренным молоком и инкубируем с первичным антителом, специфичным к белку, а затем с вторичным антителом, конъюгированным с биотин-стрептавидин-HRP. После инкубации мембрану промываем в фосфатно-солевом буфере с твином 20 (PBST) для удаления несвязанных антител. Для проявления HRP мембрану обрабатываем субстратом, содержащим биотин и стрептавидин, который вызывает химическую реакцию с образованием цветного осадка. Затем изображения белковых полос фиксируем и анализируем с использованием прибора ChemiDoc (Bio-Rad). Для количественной оценки уровня экспрессии белков используем программное обеспечение ImageJ.
  • ELISA (ИФА, иммуноферментный анализ)
    Для измерения уровня CACNA1C (Human Voltage-dependent L-type calcium channel subunit alpha-1C) в гомогенатах изолированных кардиомиоцитов используем иммуноферментный анализ (ИФА). Кардиомиоциты лизируем в буфере (10 мМ Трис, pH 8, 140 мМ NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5 мМ EGTA, 1 мМ EDTA и ингибиторы протеаз) и центрифугируем при 10,000×g в течение 5 минут. Супернатанты используем немедленно или замораживаем при ≤ -20°C. Все реагенты доводим до комнатной температуры перед использованием. Стандарты восстанавливаем в 1 мл стандартного/образцового разбавителя (R1) до концентрации 10 нг/мл и разводим серийно. Для ИФА 100 мкл стандартов и образцов добавляем в лунки микропланшета, покрытые антителами против CACNA1C, и инкубируем при 37°C в течение 2 часов. Лунки промываем PBST три раза, затем добавляем 100 мкл рабочего раствора биотинилированного антитела и инкубируем при 37°C в течение 1 часа. После повторной промывки добавляем 100 мкл рабочего раствора стрептавидин-HRP и инкубируем при 37°C в течение 1 часа. Лунки снова промываем три раза, добавляли 100 мкл субстрата ТМБ и инкубируем в темноте при 37°C в течение 15-20 минут. Реакцию останавливаем добавлением 50 мкл стоп-реагента. Абсорбцию измеряем на микропланшетном ридере при 450 нм (с коррекцией на 570 нм или 630 нм). Количественную оценку уровня экспрессии CACNA1C проводим с использованием программного обеспечения Zemfira.
• Моделирование на мелких лабораторных животных микрогравитации.
  Имитации эффекта невесомости – моделируемая микрогравитация. Эффективной моделью имитации микрогравитации или невесомости, применяемой значительным количеством авторов, является разгрузка задних конечностей грызунов [Zhong et al., 2016], иначе, вывешивании крыс за хвост [Xie et al., 2005]. Эта методика разгрузки задних конечностей (Morey-Holton and Globus, 2002) с изменениями, была подробно описана ранее (Sun et al. 2004; Zhang et al., 2003). Крыс-самцов SD прикрепляют к пластиковой планке с шарнирным соединением, установленным в верхней части клетки, что позволяло им свободно поворачиваться на 360°. Крыс содержат в положении с наклоном головы вниз приблизительно на -30°, при этом их задние конечности не были утяжелены. Крыс взвешивают ежедневно на протяжении всего эксперимента. Кроме того, в ходе эксперимента за крысами тщательно наблюдают несколько раз в день, следя за тем, как они ухаживают за собой, едят и пьют, свободно двигаются, мочатся и дефекируют, а также осматривают хвост. Контрольные крысы помещаются в идентичные клетки из оргстекла, за исключением того, что устройство для подвешивания хвоста снимают. Все животные получают стандартный лабораторный корм и воду в неограниченном количестве и содержатся в индивидуальных клетках при температуре 23°C в течение цикла "свет-темнота" продолжительностью 12:12 часов.
• Моделирование на мелких лабораторных животных гипергравитации.
  Изучение действия гипергравитации проводиться с использованием разработанной нами и раннее изготовленной в качестве имитатора перегрузок центрифуги с двумя плечами длиной 60 см каждое (аналог для грызунов имеется только в Северной Корее [Ji et al., 2021]), на концах которых находятся свободно висящие клетки с крысами, отклоняющиеся при вращении вала центрифуги [Kamkin et al., 2023-a]. Постоянная скорость вращения против часовой стрелки создает гипергравитацию (перегрузки) у животных величиной 4g. Крысы подвергаются действию гипергравитации в течение 14 дней по 8 ч в день (с 09:00 до 17:00 MSK). Контрольная группа животных размещается в том же помещении. Все животные в экспериментальной и контрольной группе имеют постоянный доступ к пище и воде. В помещении поддерживают температуру 24ºC и 12-часовой световой режим. После 14 дней пребывания в контрольных условиях и в условиях гипергравитации вес животных обеих групп увеличивается и лежит в диапазоне 215 – 235 g [Kamkin et al., 2023-a].

• Гистолого-морфологические исследования (Olympus 20.09.2011)
• Регистрация артериального давления у человека и животных (Нейроботикс 20.11.2011)
• Регистрация биоэлектрической активности клеток методом patch-clamp (Science Pribor 14.12.2011)
• Регистрация биоэлектрической активности клеток с помощью стандартной микроэлектродной техники (Science Pribor 14.12.2011)
• Регистрация внутриклеточных осцилляций ионов с помощью флуоресцентного имиджинга (Olympus 21.09.2012)
• Исследование уровня тревожности крыс (Open Science 29.09.2010)
• Оценка ориентировочно-исследовательской активности крыс (Open Science 29.09.2010)
• Исследование памяти и обучения крыс (Open science 29.09.2010)

2020 г.

• РФФИ 18-34-00977 Роль функциональной селективности агонистов ПАР1 в регуляции повреждения нервных клеток при фотоиндуцированной ишемии у грызунов. Работа выполнена в полном объеме, отчет по проекту сдан и принят без замечаний.
• ГЗ МЗ РФ «Разработка инновационного подхода, основанного на изучении связи генетических факторов, определяющих фенотип механоуправляемых ионных каналов клеток сердца с риском развития аритмий и внезапной сердечной смерти на фоне ишемической болезни сердца и разработка алгоритма ранней диагностики и лечения нарушений ритма сердца» №АААА-А18-118051590121-0. Проект выполнен в полном объеме, заключительный отчет по работе за 3 года сдан в срок, замечаний нет.
• Поисковая плановая НИР в рамках РНИМУ им. Н.И. Пирогова — «Роль механоэлектрической обратной связи в сердце». Исследовались механизмы регуляции механосенсетивных и механоуправляемых каналов.
• РФФИ 19-29-08021 Электрохимические превращения катехолатных комплексов — путь к созданию новых сенсорных материалов для свободнорадикальных процессов. Работа выполнена в полном объеме, отчет сдан.

В ходе выполнения работ в 2020 году было опубликовано 32 статьи в отечественных и зарубежных журналах.

2022 г.

• РНФ 22-25-00848 Влияние сахарного диабета на ишемическое повреждение мозга у мышей: роль паннексина-1. Работа выполнена в полном объеме, отчет по проекту сдан и принят без замечаний.
• ГЗ МЗ РФ «Регуляция механизмов активации и инактивации механоуправляемых ионных каналов фибробластов сердца, играющих ключевую роль в возникновении аритмий и фибрилляции». Работы выполнены согласно плану, промежуточный отчет сдан.
• Поисковая плановая НИР в рамках РНИМУ им. Н.И. Пирогова — «Роль механоэлектрической обратной связи в сердце». Исследовались механизмы регуляции механосенсетивных и механоуправляемых каналов. Разрабатывалось и тестировалось специализированное оборудование для исследования гипергравитации.

В течение года было опубликовано 23 работы в отечественных и зарубежных научных журналах.

2023 г.

• РНФ 22-25-00848 Влияние сахарного диабета на ишемическое повреждение мозга у мышей: роль паннексина-1. Работа выполнена в полном объеме, отчет по проекту сдан и принят без замечаний.
• ГЗ МЗ РФ «Регуляция механизмов активации и инактивации механоуправляемых ионных каналов фибробластов сердца, играющих ключевую роль в возникновении аритмий и фибрилляции».Проект выполнен в полном объеме, заключительный отчет по работе за 3 года сдан в срок, замечаний нет.
• Поисковая плановая НИР в рамках РНИМУ им. Н.И. Пирогова — «Роль механоэлектрической обратной связи в сердце». Проводились измерения Ca2+ токов L-типа при растяжении кардиомиоцитов. Исследовалось влияние гипер- и гипогравитации на транскрипты генов механоупраляемых и механосенсетивных каналов.

В течение года было опубликовано 19 работ в отечественных и зарубежных научных журналах.