Основные (опубликованные) результаты (с указанием новизны и значимости): В рамках выполнения проекта опубликована статья: Alexey V. Kuzikov, Tatiana A. Filippova, Rami A. Masamrekh, Victoria V. Shumyantseva, Electroanalysis of 4′-Hydroxydiclofenac for CYP2C9 Enzymatic Assay, Electrocatalysis volume 13, pages630–640 (2022). https://doi.org/10.1007/s12678-022-00753-3.

В рамках данной работы разработан впервые способ количественного электрохимического определения методом квадратно-волновой вольтамперометрии 4′-гидроксидиклофенака, являющегося метаболитом нестероидного противовоспалительного препарата диклофенака (маркерного субстрата CYP2C9). Мы показали, что использование дисперсии одностенных углеродных нанотрубок, стабилизированных карбоксиметилцелюллозой, для модификации электродов, использующихся для количественного определения 4′-гидроксидиклофенака, улучшает аналитические свойства электродов. Значения аналитической чувствительности определения и предела определяемых концентраций 4′-гидроксидиклофенака были рассчитаны как 0,11 мкA/мкM и 0,085 мкМ, соответственно. Впервые разработан метод электрохимического определения каталитической активности CYP2C9, иммобилизованного на модифицированных печатных графитовых электродах, путем количественного электрохимического определения 4′-гидроксидиклофенака. Значения максимальной скорости ферментативной реакции 4′-гидроксилирования диклофенака в электрохимической системе и константы Михаэлиса были определены как 5,35 ± 0,13 мин-1 и 11,66 ± 0,92 мкМ, соответственно. Полученные кинетические параметры оказались сопоставимы с аналогичными параметрами, полученными с помощью других CYP2C9-содержащих систем. Разработанная система может применяться при проведении ингибиторного анализа CYP2C9 в фармакокинетических исследованиях с использованием диклофенака как маркерного субстрата.

Цели проекта: разработка методов электрохимического анализа метаболитов клинически значимых изоформ цитохрома Р450 in vitro и в биологических системах.

Задачи проекта:

1. Произвести выбор субстратов клинически значимых изоформ цитохрома Р450 (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5), при окислении которых образуются потенциально электроактивные метаболиты. Особое внимание будет уделяться лекарственным препаратам – субстратам цитохрома Р450 ароматического ряда. К данной группе химических соединений принадлежит ряд противоэпилептических, противосудорожных, нестероидных противовоспалительных препаратов, адреноблокаторов, антагонистов эстрогенов, антидепрессантов и миорелаксантов.
2. Исследовать электроактивные свойства и электроаналитические характеристики выбранных лекарственных препаратов и их метаболитов. Установить механизмы электрохимических реакций, протекающих на электродах. Это позволит выявить пары субстрат-метаболит, которые можно определять без разделения.
3. Оценить возможность определения электроактивных метаболитов в инкубационной смеси после проведения электрокаталитических цитохром Р450-зависимых реакций. Это позволит оптимизировать условия иммобилизации фермента на электроде, оценить влияние неспецифических электрохимических реакций на окисление выбранных лекарственных препаратов.
4. Оценить возможность определения электроактивных метаболитов в многокомпонентных цитохром Р450-содержащих системах (микросомальных или реконструированных).
5. Оценить возможность определения электроактивных метаболитов в плазме крови методом добавок исследуемых лекарственных препаратов и их метаболитов. Белки, нуклеиновые кислоты и низкомолекулярные соединения, содержащиеся в плазме крови, могут вносить вклад в регистрируемые электрохимические характеристики. Таким образом, задача направлена на решение проблем, связанных с влиянием многокомпонентной биологической системы на аналитические сигналы.

Основной исполнитель: Кузиков Алексей Владимирович, доцент кафедры биохимии медико-биологического факультета, кандидат биологических наук, доцент

Лаборатория-исполнитель: Кафедра биохимии МБФ

Заказчик и номер гранта:  РНФ, 21-75-00048

Срок выполнения: С 01 июля 2021 по 30 июня 2023