Получение пациент специфических культур клеток с РДБЭ, анализ возможных нарушений экспрессии коллагена на уровне РНК и белковой экспрессии. Получение ИПСК. Разработка системы иммортализации первичных культур клеток (фибробластов), полученных от пациентов с БЭ для создания кожных моделей БЭ нового поколения.

Цели проекта:

1. Разработка методов и подбор условий культивирования первичных клеток из материала биопсии больных ВБЭ; культивирование клеток из материала биопсии людей контрольной здоровой группы. Выделение культур клеток кожи (фибробластов и кератиноцитов) будет проведено путем ферментативного разделения ткани и культивирования клеток в селективных условиях. Иммуноцитохимический анализ для подтверждения наличия патологической мутации. Разработка метода крио-консервации первичных культур клеток.
2. В случае неидентифицированной мутации – провести секвенирование на широкой панели вовлеченных в заболевание генов.
3. Подбор стратегии геномной модификации клеток от больных с идентифицированной мутацией. В зависимости от типа мутации, нуклеотидного состава окружения будет выполнен выбор метода, определена синтетическая нуклеаза и дизайн направляющих РНК или клонирование донорной последовательности, несущей исправленный вариант нуклеотидной последовательности без мутации. Осуществлен выбор типа донорной молекулы: двухцепочечная ДНК донора или одноцепочечная ДНК.
4. Проверка работы метода геномного редактирования на модельной культуре клеток с высокой эффективностью трансфекции. Оценка работы направляющих РНК в этой системе. Секвенирование клонов после редактирования. Оценка неспецифической активности направляющих РНК.

Основной исполнитель:  Гурская Надежда Георгиевна, Вед. научный сотрудник, к.б.н.

Лаборатория-исполнитель: Отдел регенеративной медицины

Заказчик и номер гранта: РФФИ, 19-29-04044 мк

Срок выполнения: 2019-2022 гг.